LAPORAN PCR

HASIL

Dalam praktikum baru dilaksanakan samapi pada tahap running. Untuk mengetahui hasil PCR, baru didapatkan setelah melakukan elektroforesis. Sehingga kita baru mendapatkan campuran berwarna hijau antara green do taq master mix dengan primer (IF2 dan IR2), ddw dan template pada PCR tube

PEMBAHASAN

Pertama-tama yang kita lakukan adalah mengambil 25 UL green go taq master mix menggunakan mikropipet yang sangat steril ke dalam PCR tube. Tahap ini hanya boleh dilakukan didalam mesin EBSSCO untuk menjaga kesterilan green go taq master mix tersebut. GGTMM sendiri merupakan campuran dari komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses PCR  selain primer, template.

Langkah selanjutnya adalah ,memasukkan primer (IF2 & IR2) masing-masing sebanyak 1 UL. Primer ini berfungsi untuk mengenali sequence dari DNA yang ingin diamplifikasi dalam proses PCR ini. Untuk tahap selanjutnya dilakukan di meja steril.. kemudian masukkan 18 UL ddw yang digunakan sebagai pelarut. DDW dipilih sebagai pelarut karena tidak mengandung DNAse. Selanjutnya, masukkan template sebanyak 5 UL. Template ini digunakan sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi.

JIka semua bahan yang dibutuhkan sudah dimasukkan ke dalam PCR tube, maka langkah selanjutnya adalah men-spin down . Spin down dilakukan untuk memastikan semua campuran yang menempel pada tutup atau dinding bagian atas tabung, berpindah ke bagian bawah tabung. Hal ini dimaksudkan agar proses PCR berjalan semaksimal mungkin. Selanjutnya, PCR tube dimasukkan ke dalam mesin PCR yang dimana akan terjadi proses pre-heating pada suhu 94 C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 c selama 36 detik, annealing pada suhu 60 C selama 36 detik elongasi pada suhu 72 C selama 1 menit, dan terakhir proses extra elongasi pada suhu 72 C selama 10 menit.

Denaturasi sendiri merupaka proses pemisahan untai ganda DNA dengan merusak ikatan hydrogen pada DNA, maka darai tu dibutuhkan suhu yang tinggi (94 c). Annealing merupakan proses penempelan primer pada sequence DNA yang sesuai. Ekstensi adalah proses pemanjangan DNA replikan dari DNA template. Extra Elongasi dilakukan untuk memastikan bahwa semua proses extensi telah terjadi. Proses denaturasi, anneling dan ekstensi dilakukan selama 4o siklus, sehingga mendapatkan copy DNA target dalam jumlah yang banyak, sehingga memudahkan dalam menganalisa hasil PCR pada proses elektroforesis.

DISKUSI

Dalam praktikum ini, yang harus dilakukan dalam lemari steril adalah saat pemasukan GGTMM, untuk primer dan ddw dapat dilakukan di meja steril. Sedangkan untuk pemasukan template harus diluar lemari steril, karena template dianggap sebagai kontaminan, Kesterilan sangat diperhatikan karena akan sangat menentukan keberhasilan proses PCR nantinya.

GGTM sendiri disimpan dalam bentuk es karena DNA polymerase mulai bekerja ketika GGTMM mencair. Cara pencairannya adalah dengan thawing atau dibiarkan saja, setelah mencair, GGTMM disentrifuge terlebih dahulu, tujuannya adalah untuk menjatuhkan cairan yang ada di tutup tabung ke bagian bawah tabung.

Dalam praktikum ini kami baru sampai pada proses spin-down, proses running sendiri dilakukan oleh assistant karena keterbatasan waktu.  Proses running diasumsi berjalan sesuai teori

Kesimpulan

Proses PCR dapat dilakukan untuk mengamplifikasi sekuens DNA yang diinginkan, dalam melakukan proses PCR diperlukan ketelitian dan kesterilan tinggi karena akan mempengaruhi keberhasilan proses PCR.