Laporan elektroforesis

Hasil :

Setelah melakukan praktikum elektroforesis di dapatkan gambar hasil visualisasi seperti gambar di samping

Well 1 : terlihat marker

Well 2 : tidak terlihat pita DNA hasil ekstraksi dari whole blood (sampel 1)

Well 3 : tidak terlihat pita DNA hasil ekstraksi dari whole blood (sampel 2)

Well 4 : terlihat pita DNA hasil PCR (…Bp)

Pembahasan

Elektroforesis adalah suatu metode analisis yang sederhana, cepat dan mempunyai sensitivitas yang tinggi dan sering digunakan untuk mengkarakterisasi massa molecular polinukleotida dan polipeptida, seperti kemurnian, heterogenesitas/ adanya degradasi dan komposisi subunit polinukleotidan dan polipeptida

Dalam praktikum ini yang kita lakukan adalah elektroforesis asam nukleat. Pertama-tama yang harus dilakukan adalah membuat gel agarose. Gel agarose sendiri berfungsi untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100bp (sbg penyaring). Konsentrasi agarose mempengaruhi hasil elektroforesis, karena semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarose lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya. Untuk membuat gel agarose dapat kita lakukan dengan mencamputkan serbuk agarose dengan TAE/TBE. Dalam praktikum ini kita ingin membuat gel agarose dengan konsentrasi 1 % maka serbuk agarose yang dibutuhkan sebanyak 2 gr dan kita menggunakan TAE (tris-asetad-EDTA) sebanyak 200ml. (MASUKKAN FUNGSI TAE DISINI, CARI DALAM BUKU) kemudian larutkan serbuk agarose dengan cara memanaskan dalam microwave. Setelah itu aduk dengan menggunakan magnetic stirrer sampai tercampur rata. Setelah mendapatkan larutan yang sudah tercampur rata, tambahkan dengan EtBr sebanyak 10 % dari larutan awal (20ml) . EtBr berfungsi untuk memancarkan cahaya ketika disinari UV saat dilakukan visualisasi elektroforesis (akan menimbulkan warna jingga). Letakkan comb pada cetakan agarose dan lakukan penuangan agarose. Comb diletakkan dalam cetakan untuk membentuk well(sumuran). Lalu didiamkan hingga mengeras. Setelah membuat gel agarose, langkah selanjutnya adalah merakit alat elektroforesis, letakkan agarose dalam mesin, masukkan TAE hingga agarose terendam, kemudian masukkan marker pada well pertama dengan mikropipet. Marker berguna sebagai patokan/ penanda panjang pita DNA. Kemudian masukkan sampel 1 dengan pipeting (hasil ekstraksi DNA dari darah utuh) pada well kedua , yang sudah dicampur dengan loading dye. Loading dye berfungsi sebagai pemberat dan pewarna dari sampel, sehingga mudah dilihat saat proses pemasukan ke dalam well. Lakukan hal yang sama pada well ke empat dan ke lima yang berturut-turut berisi sampel 2 (hasil ekstraksi darah utuh) dan sampel hasil PCR. Lalu dialiri listrik dan atur waktunya. Diamkan beberapa saat, setelah selesai, masukkan gel agarose ke dalam mesin …. (cari namanya) untuk melihat hasil elekroforesis

DISKUSI

Pada hasil pengamatan, dapat terlihat bahwa pada well 2 yang berisi sampel 1 whole blood dan well 3 yang berisi sampel 2 whole blood ternyata tidak menunjukkan hasil atau pergerakan TAE tidak terlihat.

Pada well 2 dan 3 DNA tidak terlihat, hal ini dapat disebabkan oleh berbagai hal seperti rusaknya DNA atau dikarenakan kurang murninya sampel yang digunakan menjadi hasil, karena pada waktu isolasi DNA, kami tidak mengulangi proses pemurnian DNA atau DNA ikut terbuang saat membuang supernatant atau dapat juga DNA yang dihasilkan terlalu sedikit

Sedangkan pada well 4 yang berisi PCR hasil dapat terlihat dan dapat dibandingkan dengan marker (well 1)

Kesimpulan

Saat elektroforesis didapatkan hanya satu pita yang terlihat yaitu pita hasil PCR

LAPORAN PCR

HASIL

Dalam praktikum baru dilaksanakan samapi pada tahap running. Untuk mengetahui hasil PCR, baru didapatkan setelah melakukan elektroforesis. Sehingga kita baru mendapatkan campuran berwarna hijau antara green do taq master mix dengan primer (IF2 dan IR2), ddw dan template pada PCR tube

PEMBAHASAN

Pertama-tama yang kita lakukan adalah mengambil 25 UL green go taq master mix menggunakan mikropipet yang sangat steril ke dalam PCR tube. Tahap ini hanya boleh dilakukan didalam mesin EBSSCO untuk menjaga kesterilan green go taq master mix tersebut. GGTMM sendiri merupakan campuran dari komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses PCR  selain primer, template.

Langkah selanjutnya adalah ,memasukkan primer (IF2 & IR2) masing-masing sebanyak 1 UL. Primer ini berfungsi untuk mengenali sequence dari DNA yang ingin diamplifikasi dalam proses PCR ini. Untuk tahap selanjutnya dilakukan di meja steril.. kemudian masukkan 18 UL ddw yang digunakan sebagai pelarut. DDW dipilih sebagai pelarut karena tidak mengandung DNAse. Selanjutnya, masukkan template sebanyak 5 UL. Template ini digunakan sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi.

JIka semua bahan yang dibutuhkan sudah dimasukkan ke dalam PCR tube, maka langkah selanjutnya adalah men-spin down . Spin down dilakukan untuk memastikan semua campuran yang menempel pada tutup atau dinding bagian atas tabung, berpindah ke bagian bawah tabung. Hal ini dimaksudkan agar proses PCR berjalan semaksimal mungkin. Selanjutnya, PCR tube dimasukkan ke dalam mesin PCR yang dimana akan terjadi proses pre-heating pada suhu 94 C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 c selama 36 detik, annealing pada suhu 60 C selama 36 detik elongasi pada suhu 72 C selama 1 menit, dan terakhir proses extra elongasi pada suhu 72 C selama 10 menit.

Denaturasi sendiri merupaka proses pemisahan untai ganda DNA dengan merusak ikatan hydrogen pada DNA, maka darai tu dibutuhkan suhu yang tinggi (94 c). Annealing merupakan proses penempelan primer pada sequence DNA yang sesuai. Ekstensi adalah proses pemanjangan DNA replikan dari DNA template. Extra Elongasi dilakukan untuk memastikan bahwa semua proses extensi telah terjadi. Proses denaturasi, anneling dan ekstensi dilakukan selama 4o siklus, sehingga mendapatkan copy DNA target dalam jumlah yang banyak, sehingga memudahkan dalam menganalisa hasil PCR pada proses elektroforesis.

DISKUSI

Dalam praktikum ini, yang harus dilakukan dalam lemari steril adalah saat pemasukan GGTMM, untuk primer dan ddw dapat dilakukan di meja steril. Sedangkan untuk pemasukan template harus diluar lemari steril, karena template dianggap sebagai kontaminan, Kesterilan sangat diperhatikan karena akan sangat menentukan keberhasilan proses PCR nantinya.

GGTM sendiri disimpan dalam bentuk es karena DNA polymerase mulai bekerja ketika GGTMM mencair. Cara pencairannya adalah dengan thawing atau dibiarkan saja, setelah mencair, GGTMM disentrifuge terlebih dahulu, tujuannya adalah untuk menjatuhkan cairan yang ada di tutup tabung ke bagian bawah tabung.

Dalam praktikum ini kami baru sampai pada proses spin-down, proses running sendiri dilakukan oleh assistant karena keterbatasan waktu.  Proses running diasumsi berjalan sesuai teori

Kesimpulan

Proses PCR dapat dilakukan untuk mengamplifikasi sekuens DNA yang diinginkan, dalam melakukan proses PCR diperlukan ketelitian dan kesterilan tinggi karena akan mempengaruhi keberhasilan proses PCR.

ISOLASI DNA PLASMA DARAH

hasil

dari praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil ekstraksi berupa pelet berwarna putih yang siap untuk diperiksa pada praktikum selanjutnya

pembahasan

ekstraksi DNA dari plasma darah memiliki beberapa perbedaan jika dibandingkan dengan ekstraksi DNA dari darah utuh, salah satu perbedaannya adalah tujuan dari ekstraksi, pada ekstraksi dari plasma darah, umumnya digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisi DNA asing dalam sampel, sedangkan ekstraksi dari darah utuh umumnya bertujuan untuk menganalisis DNA sampel itu sendiri.

Untuk mengekstraksi DNA dari plasma darah, pertama-tama darah utuh di sentrifugasi hingga terdapat 2 lapisan, lapisan paling atas mengandung plasma darah,sedangkan bagian bawahnya, yang berwarna lebih gelap mengandung komponen-komponen sel darah lainnya. Kemudian kita ambil bagian atas tersebut sebanyak 100 UL. Pada sample plasma darah 100 UL tersebut ditambahkan 200 UL TE (tris EDTA) yang berfungsi untuk pengencer.TE mengikat ion MG2+ yang merupakan kofaktor dari enzim DNAse yang berfungsi untuk denaturasi DNA, sehingga DNA lebih awet/stabil

Kemudian ditambahkan PCI (phenol, Chloroform,  Isoamylalcohol) yang berfungsi untuk melisiskan protein, dengan perbandingan 24:25:1 sebanyak  100UL, kemudian divortex hingga tercampur rata, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm, 4 C selama 3 menit, kemudian akan muncul 3 lapisan, lapisan atas yang bening yang mengandung DNA, lapisan yang berwarna putih kental yang mengandung protein dan lapisan bawah yang mengadung phenol.

Kita ambil lapisan paling atas sebanyak 150 UL kemudian lakukan presipitasi DNA dengan menggunakan NoOAc sebanyak 10 % dari volume cairan DNA tersebut (15 UL), dan ditambahkan EtOH 100% dengan perbandingan 2:1 dengan volume total DNA ditambah NoOAc (330 UL), kemudian diinverting, dan disentrifugasi dengan kecepatan 14000rpm 4 C selama 5 menit, buang supernatant, kemudian tambahkan 500 UL EtOH 70% untuk mencuci sampel dari reagen-reagen sebelumnya, sentrifuge lagi dengan kecepatan 14000rpm 4 C selama 5 menit, lakukan air drying, lalu setelah kering tambahkan TE 100 UL untuk mendapatkan hasil sampel berwujud cair

DISKUSI

Pada saat praktikum terdapat satu langkah yang tidak kami lakukan, yaitu mengulang proses pemurnian larutan DNA dari protein menggunakan larutan TE dan PCI yang bertujuan meminimalisasi protein yang terkandung saat pengambilan DNA. Hal ini disebabkan terbatasnya waktu yang ada. Akibat dari hal ini, terdapat kemungkinan setelah dianalisis lebih lanjut, hasil ekstraksi DNA kurang murni, dan dapat mempengaruhi proses-proses berikutnya.

KESIMPULAN

Ekstraksi DNA pada plasma darah bertujuan untuk mngisolasi DNA/RNA asing, yang bukan merupakan DNA asli sampel. Hasil yang didapatkan dari kedua sampel adalah pellet berwarna putih yang merupakan hasil isolasi DNA.